第三类体外诊断试剂产品注册技术审评报告：胚胎植入前地中海贫血基因检测试剂盒（半导体测序法）

技术审评概述

一、产品概述

（一）产品主要组成成分

（二）产品预期用途

本产品用于定性检测试管婴儿体外培养胚胎的囊胚滋养层细胞样本及其父母双方和（或）相关亲属全血样本基因组 DNA中 HBA1、HBA2 基因和 HBB 基因区域及其上、下游 1Mb 范围内高频的 SNP 位点，通过连锁分析判断胚胎是否遗传了来自父母的 α-地中海贫血相关基因 HBA1、HBA2 突变和（或）β-地中海贫血相关基因 HBB 突变，辅助临床医生选择合适的胚胎进行植入。

本产品适用于双方均携带已知 α-地中海贫血致病变异或均携带已知 β-地中海贫血致病变异，且具有生育中间型或重型地中海贫血患者风险的夫妇。检测结果仅供参考，不单独作为确诊的依据。

（三）产品包装规格

50 人份/盒。

（四）产品检验原理

本试剂盒是利用高通量测序对 α-地中海贫血相关基因HBA1、HBA2 和 β-地中海贫血相关基因 HBB 及其上下游连锁的 SNP 位点进行检测，根据已知明确家系构建父母单体型，再通过连锁分析判断胚胎的基因型。

对 HBA1、HBA2 基因和 HBB 基因区域及其上、下游 1Mb范围内高频的 386 个 SNP 位点设计多重 PCR 引物，覆盖的选定区域片段长度约 79kb，以囊胚滋养层细胞经全基因组扩增后的DNA 及其父母双方和（或）相关亲属基因组 DNA 为模板，扩增选定区域，在扩增后的 DNA 片段两端加上通用的测序接头，构建测序文库，然后进行高通量测序。

测序完成后，使用本试剂盒的配套分析软件进行数据分析，通过已知明确的家系图谱，利用遗传规律和 SNP 连锁分析方法，确定夫妻双方致病位点区域的单体型，再通过连锁分析判断胚胎样本是否携带致病变异，从而确定胚胎的基因型。

二、临床前研究概述

（一）主要原材料

1.主要原材料的选择

主要原材料包括：等温扩增酶、地贫引物混合液 1、地贫引物混合液 2、PCR 扩增混合液、DNA 连接酶、地贫 P1-1 接头引物、地贫 P1-2 接头引物、地贫特异性接头 A1-1 至 A25-1 引物、地贫特异性接头 A1-2 至 A25-2 引物、文库定量 PCR 酶混合液、地贫定量引物 F 和地贫定量引物 R、文库定量标准品、质控品等，这些原材料均为外购方式获得。其中地贫引物混合液、地贫接头引物、地贫定量引物为申请人自行设计后由专业的合成公司合成纯化获得。

申请人通过功能性试验筛选出最佳原材料和供应商，制定了各主要原材料的质量要求并经检验合格。

2.企业参考品和质控品设置情况

企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品和重复性参考品。由地中海贫血家系样本建立的永生化细胞系和永生化细胞系提取纯化的 DNA 制备而成。企业参考品原材料均为外购，所有家系地中海贫血基因变异信息采用 STR 连锁分析、Sanger 测序及 Gap-PCR 方法进行确认。

试剂盒同时设置了质控品，用于检测过程中的质量控制。

（二）生产工艺及反应体系研究

申请人对试剂盒反应体系的研究包括细胞裂解反应体系及反应条件、等温扩增反应体系及反应条件、靶标富集反应体系及反应条件、文库构建反应体系及反应条件、文库定量反应体系及反应条件等，通过功能性试验，最终确定了最佳的反应体系。

申请人根据试剂盒中试剂及组件的主要生产工艺的研究结果，确定了最佳的生产工艺。

（三）分析性能评估

分析性能评估内容主要包括：准确度、精密度、检出限、分析特异性等。申请人提交了三批产品在适用机型上的性能评估资料。

准确度研究中，使用三批成品试剂盒在适用机型上对企业参考品进行重复 3 次检测，检测结果显示准确性、特异性均为100%；同时，使用临床样本进行研究，临床样本涵盖常见地中海贫血基因突变类型，试剂盒检测结果与对照方法检测结果一致率为 100%。

精密度研究中，使用企业参考品和临床样本对批内、批间、不同操作者间、不同仪器间、不同实验室间的精密度进行了综合评价。研究结果表明，试剂盒在批内、批间、日内、日间、不同操作者间、不同仪器间、不同实验室间的精密度均较好，试剂性能稳定。

检出限研究中，使用具有代表性突变的临床样本，对不同DNA 投入量和不同 SNP 位点突变比例的混合样本进行研究，并分别进行了最低检出限的建立和验证。确定试剂盒的最低检出限为 DNA 投入量为 50ng，SNP 位点的最低检出限为突变比例30%。

分析特异性研究中，使用含胆红素、甘油三酯、血红蛋白、白蛋白、叶酸、降压药（氢氯噻嗪）、降糖药（盐酸二甲双胍）、爱乐维和对乙酰氨基酚干扰物的临床全血样本和含胚胎培养液干扰物的临床胚胎细胞样本进行检测，检测结果表明全血样本中胆红素浓度≤342μmol/L、甘油三脂浓度≤37mmol/L、血红蛋白浓度≤2g/L、白蛋白浓度≤60g/L、叶酸浓度≤0.38mg/L、降压药氢氯噻嗪浓度 ≤0.05mg/mL 、降糖药盐酸二甲 双胍浓度≤1.00mg/mL、 爱乐维浓度 ≤35.6mg/L、对乙酰氨基酚浓度≤1.00mg/mL，胚胎活检细胞样本中胚胎培养液≤4μL，均对试剂盒的检测结果无干扰。

申请人采用临床样本进行了核酸提取试剂盒性能的研究并根据与本产品和测序反应通用试剂的组合性能研究结果，确定配套的核酸提取试剂和测序反应通用试剂符合检测需求。

（四）阳性判断值或参考区间研究

申请人采用 4 个企业参考品家系和 14 个地贫家系临床样本，进行阳性判断值确定研究。利用随机抽取扩增子数据的方法进行大规模模拟实验，以 Sanger 测序、STR 连锁分析作为对照方法，确定阳性判断值。

申请人进一步采用多例代表性地贫家系的临床样本进行阳性判断值的验证，确认了阳性判断值设置合理。

（五）稳定性研究

申请人进行的稳定性研究，包括实时稳定性、开瓶和冻融稳定性、运输稳定性等。研究结果表明试剂盒中 DNA 纯化磁珠储存于 2~8℃，其余所有试剂均储存于-20±5℃，有效期为 6 个月；试剂盒开瓶稳定期为 5 个月，试剂盒冻融次数不超过 12 次；试剂盒运输条件为冷链运输，时间不应超过 5 天。

此外，申请人对样本稳定性进行了研究，研究结果显示产品的性能均满足产品说明书声称的要求。

三、临床评价概述

申请人在广州医科大学附属第三医院、海南医科大学第一附属医院、柳州市妇幼保健院共三家临床试验机构开展了临床试验。临床试验入组受试者为双方均携带已知 α-地中海贫血致病变异或均携带已知 β-地中海贫血致病变异，且具有生育中间型或重型地中海贫血患者风险的夫妇。样本类型为试管婴儿体外培养胚胎的囊胚滋养层细胞样本及其父母双方和（或）相关亲属的外周静脉全血样本。 临床试验共入组 198 对受试者夫妻的 1190 例胚胎样本，其中α-地中海贫血家系 143 个，检测胚胎样本 868 例；β-地中海贫血家系 74 个，检测胚胎样本 447例。临床试验中共检测到 9 种α-地中海贫血致病单体型和 9 种β-地中海贫血致病单体型，覆盖了临床常见变异类型。临床试验共分为以下七部分：

（一）与对比方法 STR 的比较研究

共纳入统计分析 1120 例样本，采用试验体外诊断试剂与STR 连锁分析方法进行比对，其中 STR 检测结果阳性 846 例，阴性 274 例，试验结果表明，试验体外诊断试剂与对比方法的阳性符合率为 100%（95%CI：99.55%，100%），阴性符合率为100%（95%CI：98.62%，100%），总符合率为 100%（95%CI：99.66%，100%）。试验结果显示，试验体外诊断试剂与对比方法检测结果的一致性较好。

（二）与临床参考标准的比较

同时采用试验体外诊断试剂与临床参考标准，即临床诊断结果进行比较研究，共纳入 1129 例样本，其中临床诊断结果阳性 860 例，阴性 269 例。试验结果表明，试验体外诊断试剂与临床诊断结果的灵敏度为 100%（95%CI：99.56%，100%），特异度为 99.26%（95%CI：97.33%，99.80%），总符合率为 99.82%（95%CI：99.36%，99.95%）。

（三）与产前诊断结果的比较

临床试验共随访到 234 例植入胚胎的 107 例产前诊断地中海贫血基因检测结果，其中α-珠蛋白基因阳性验证例数为 39例、β-珠蛋白基因阳性验证例数为 25 例。试验结果表明，试验体 外诊断试剂与 产前诊断结果 比较的 灵敏度 为 100%（95%CI：94.34%，100%），特异度为 98.31%（95%CI：91.01%，99.70%），总符合率为99.19%（95%CI：95.54%，99.86%）。

（四）与 Sanger 测序的比较研究

针对点突变型地贫同时采用 Sanger 测序方法对胚胎的HBA1、HBA2 基因和 HBB 基因进行检测，共纳入 509 例样本，采用试验体外诊断试剂与 Sanger 测序方法进行比对，其中Sanger 测序检测结果阳性 321 例，阴性 188 例，试验结果表明，试验体外诊断试剂与 Sanger 测序阳性符合率为 100%（95%CI：98.82%，100%），阴性符合率为 95.74%（95%CI：91.83%，97.83%），总符合率为 98.43%（95%CI：96.93%，99.20%）。针对不一致样本，进行了充分合理的分析，且同时结合 STR 方法进行了分析，试验体外诊断试剂检测结果均与 STR 对比方法结果一致。

（五）位点覆盖率的分析

临床试验中共检出 1220 个有效分型位点，其中针对产品设计的 386 个位点共检出 358 个，覆盖率为 92.75%。

（六）SNP 位点检测一致性的评价

针对此部分研究，共入组了 120 例血液样本，采用试验体外诊断试剂与自建 NGS 方法进行比较研究。检测结果显示，两种方法的测序一致率范围为 99.87%～99.99%，平均值为99.97%，表明两种方法针对 SNP 位点的测序一致性较好。

（七）胚胎检测位点与家系检测位点的一致性评价

临床试验中试验体外诊断试剂检测的 1289 例样本中，胚胎检出的有效分型位点与家系有效分型位点的符合率平均为98%。

综上所述，临床试验结果显示该产品临床性能满足技术审评要求。

四、产品受益风险判定

根据申请人提供的申报资料，经综合评价，在目前认知水平上，认为该产品的上市为适用人群带来的受益大于风险。尽管目前认为该产品的受益大于风险，但为保证用械安全，基于对主要剩余风险的规避，需要在说明书中提示以下信息：

1.该检测结果仅供参考，不单独作为确诊的依据。

2.警示及注意事项：该试剂盒说明书中明确了该试剂盒检测方法的局限性及使用中的注意事项。

综合评价意见

本申报项目为境内第三类体外诊断试剂产品注册，属于优先审批项目。依据《医疗器械监督管理条例》（国务院令第 739号）、《体外诊断试剂注册与备案管理办法》（国家市场监督管理总局令第 48 号）等相关医疗器械法规与配套规章，经对申请人提交的注册申报资料进行系统评价,申报产品符合安全性、有效性的要求，符合现有认知水平，建议准予注册。